تحقیق بررسی تكوین یك روش گاز كروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیك

تحقیق بررسی تكوین یك روش گاز كروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیك در 60 صفحه ورد قابل ویرایش
دسته بندی فنی و مهندسی
فرمت فایل doc
حجم فایل 51 کیلو بایت
تعداد صفحات فایل 60

تحقیق بررسی تكوین یك روش گاز كروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیك

فروشنده فایل

کد کاربری 6017

تحقیق بررسی تكوین یك روش گاز كروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیك در 60 صفحه ورد قابل ویرایش

چكیده

در این تحقیق یك روش ساده و كم هزینه به منظور تعیین مقدار آمانتادین در سرم با استفاده از دستگاه گاز كروماتوگراف طراحی گردید.

در این روش از گاز حامل نیتروژن ، ستون OV17 و دتكتور FID به همراه استاندارد داخلی پسودوافدرین استفاده شد. نمونه ها توسط اسید پركلریك پروتئین زدایی شده و عمل استخراج توسط اتر انجام گردید كه بازیافت روش كامل بود.

در شرایط مذكور پیك آمانتادین ،‌استاندارد داخلی از یكدیگر و مواد آندوژن به خوبی جدا گردید. ضریب تغییرات درون روزی و بین روزی روش آنالیز در حد قابل قبول بوده و حد آشكارسازی روش 8/0 محاسبه شد.

واژه های كلیدی: آمانتادین ،‌ساس ،‌پلاسما

پیشگفتار

آمانتادین دارویی ضد ویروسی است كه دارای خواص آنتی پاركینسونی است

بیماری پاركینسون چهارمین بیماری شایع نورودژنراتیو در افراد مسن است . كه 1% افراد بالای 65 سال و 4/0% افراد بالای 40 سال را تحت تأثیر قرار می‌دهد . سن متوسط شروع حدود 57 سال است . ( 1 )
ایتولوژی و پاتوفیزیولوژی :

در پاركینسون اولیه ، نورونهای جسم سیاه و ساقه مغز از دست می‌ روند كه دلیل آن شناخته نشده است . از دست رفتن این نورنها باعث كاهش نوروترنسمی‌تر دو پامین در این مناطق می‌ شود . شروع معمولاً بعد از 40 سال است .

پاركینسونسیم ثانویه ، در اثر بیماریهای ایدیوپاتیك دژنراتیو ، داروها ، یا توكسین ها ایجاد می‌ شود . شایع ترین دلیل پاركینسونیسم ثانویه مصرف داروهای آنتی سایكوتیك و رزرپین است كه بوسیله بلوك رسپتورهای دو پامین باعث پاركینسون می‌ شوند . دلایل دیگر عبارتند از مونواكسید كربن مسمومی‌ت با منگنز ، هیدروسفالوس ، تومورها و انفاركت هایی كه مغز می‌انی را تحت تأثیر قرار می‌ دهند . ( 1 )

داروهایی كه سبب ایجاد سندرم پاركینسونیسم می‌ شوند یا آنتاگونیست رپستورد و دوپامین هستند ( مثل داروهای آنتی سایكوتیك ) ، یا سبب تخریب نورونهای دوپا منیرژیك در نیگرو استر یا تال می‌ شوند . ( مثل MPTP ) ( 2 )
علائم و نشانه های بالینی :

در 50 تا 80 درصد بیماران ، بیماری بی سرو صدا و غافلگیرانه با 4 تا 8 HZ ترمور ( Pill – rolling ) یك دست شروع می‌ شود . ترمور و لرزش در حال استراحت بیشترین مقدار است و در حال حركت كمتر می‌ شود . و در هنگام خواب ناپدپد می‌ شود . و با فشارهای روحی و خستگی بیشتر می‌ شود . معمولاً دست ها و بازوها و پاها بیشتر تحت تأثیر قرار می‌ گیرند . و به همین ترتیب فك ، زبان ، پلك هم می‌ توانند تحت تأثیر قرار بگیرند . اما صدا لرزش پیدا نمی‌ كند . در خیلی از بیماران فقط ریجیدیتی رخ می‌ دهد . و لرزش وجود ندارد . سفتی پیشرفت می‌ كند و حركات كند می‌ شود . ( برادی كاردی ) یا كم می‌ شوند ( هیپوكینزیا ) و یا شروع حركات سخت می‌ شود ( آكینزیا ) .

كه سختی و هیپوكینزی ممكن است منجر به درد و احساس خستگی شوند . صورت شبیه ماسك می‌ شود . با دهان باز و ناپدپد شدن برق چشم ها كه ممكن است بادپرسیون اشتباه شود . راه رفتن مشكل می‌ شود . فرد به این سو و آن سو حركت می‌ كند و خودش را می‌ كشد . قدم ها كوتاه و بازوها در كنار كمر ثابت اند و حركت نمی‌ كنند. ( 1 )
درمان

بیماری پاركینسون معمولاً پیشرونده است و منجر به ناتوانی فزاینده می‌ شود مگر اینكه درمان موثر انجام گیرد . غلظت دوپامین كه بطور طبیعی در هسته های قاعده ای مغز بالا می‌ باشد در پاركینسونیسم كاهش می‌ یابد . تلاش های دارویی برای تقویت فعالیت دوپامینرژیك با آگوسیت های دوپامین توفیقاتی در تخفیف تعداد زیادی از علایم كلینیكی این عارضه داشته است . یك رویكرد دیگر كه مكمل روش قبل است عبارتی از ایجاد تعادل طبیعی بین تأثیرات كولینرژیك و دوپامینرژیك روی هسته های قاعده ای توسط داروهای آنتی موسكارینی می‌ باشد . ( 2 )
2 ـ 1 ـ فارماكوكینتیك :

جذب : به راحتی و اغلب به طور كامل از دستگاه گوارش جذب می‌ شود . یك دوز mg100 خوراكی آن سطح سرمی‌ در مدت 8 ـ 1 ساعت ایجاد می‌ كند( 6 ) اوج غلظت پلاسمایی 4 ساعت بعد از‌مصرف ایجاد می‌ شود. (4 و5)

حداكثر غلظت بافتی هنگامی‌ كه دوز mg100 هر 12 ساعت مصرف شود در مدت 48 ساعت ایجاد می‌ شود ( 6 )
انتشار :

بعد از مصرف خوراكی آمانتادین در بافتهایی مانند قلب و كلیه و كبد و شش ها یافت شده است . از جفت و سد خونی ـ‌‌ مغزی عبور می‌ كند و همچنین به شیر ترشح می‌ شود . پروتئین با یندینگ آن در حدود 67% است . ( 4 )
دفع :

بیشتر دارو به صورت دست نخورده از طریق فیلتراسیون گلومرولی دفع می‌ شود . هر چند متابولیت استیله هم در ادرار ردیابی شده است . (‌4 )

در حدود 56% دوز به صورت دست نخورده در مدت 24 ساعت در ادرار وارد می‌ شود و در حدود 86% آن در طی 4 روز وارد ادرار می‌ شود . ( 6 )‌
3 ـ 1 فارماكولوژی

مكانیسم دقیق آن شناخته نشده است اما تصور می‌ شود باعث ریلیز دو پامین از انتهای دو پامینرژیك اعصابی می‌ شود كه در جسم سیاه افراد پاركینسونی باقی مانده اند . ( 7 ) در بیماری انفلوانزا ، آمانتادین از نفوذ ذرات RNA ویروس به سلول می‌زبان جلوگیری می‌ كند . همچنین از نسخه برداری ویروس جلوگیری می‌ نماید ( 6 )
4 ـ 1 عوارض جانبی

عوارض معمولاً وابسته به دوز هستند و نسبتاً خفیف می‌ باشند. غلظت های پلاسمایی بالا از آمانتادین ( 1 تا 5 میكروگرم در میلی لیتر) با پاسخ های نورتوكسیك جدی همراه است شامل : تحریك پذیری ، اشكال در تمركز ، سرگیجه ،‌ گیجی ، بی خوابی ، سردرد تغییرات خلق یا واكنش های سایكوتیك ، توهمات، هذیان ، تشنج یا كوما و آریتمی‌‌های قلبی ( 3 )

اثرات نوروتوكسیك آمانتادین با مصرف همزمان آنتی هیستامین ها ، داروهای سایكوتروپیك و آنتی كولینرژیك ها مخصوصاً در افراد مسن تر افزایش می‌ یابد . ( 3 )

سایر عوارض آمانتادین شامل هیپوتانسیون ارتواستاتیك ، ادم محیطی ، آتاكسی ، لتارژی، تهوع و استفراغ ، بی اشتهایی ، خشكی دهان ، یبوست ، راش پوستی ، تاری دید ، حساسیت به نور ، لكوپنی و CHF .
5 ـ 1 تداخل دارویی

ممكن است اثرات آنتی كولینرژیك ها را تشدید كند ( 4 )

داروهایی كه PH ادرار را بالا می‌ برند ممكن است ترشح آمانتادین در ادرار را كم كنند.(4 )‌
6 ـ 1 شكل دارویی و مورد مصرف

آمانتادین با نام های تجاری Mantadix , Antadine , symmetrel , symadine , Virofral در اشكال كپسول 100M و شربت در بازار دارویی دنیا وجود دارد ( 1 و 5 )

آمانتادین یك آگونیست ضعیف دو پامین و دارای خواص آنتی موسكارینی است . همچنین آنتاگونیست رسپتورهای N ـ متیل ـ D ـ آسپارتات می‌ باشد . آمانتادین دارای خواص آنتی پاركینسونی است و در درمان مخصوصاً در مراحل اولیه بیماری بكار می‌ رود . در بهبود علائمی‌ مانند برادی كینزی ـ سفتی و لرزش مفید است . اما ممكن است كم كم نسبت به آن مقاومت ایجاد شود ( 4)

در درمان پاركینسون معمولاً با دوز mg100 در روز شروع می‌ شود و تا دوز 100 mg دوبار در روز افزایش می‌ یابد . گاهی هم تا دوز mg 400 در روز استفاده می‌ شود . اما این دوز نباید بیشتر شود . ( 4 )

در افراد بالای 65 سال به دلیل كاهش كلیرانس كلیوی در این گروه سنی باید حداقل دوز موثر استفاده شود . ( 4 )‌
1 ـ 3 ـ 2 گاز حامل

یك استوانه گاز با فشار زیاد به عنوان منبع گاز حامل به كار برده می‌ شود . در كار با GC در دمای ثابت ، نفوذ پذیری ستون در طول مدت تجزیه تغییر نمی‌ كند . برای آنكه فشار یكنواختی به ابتدای ستوان وارد شود و در نتیجه سرعت جریان گاز ثابت بماند ، باید از یك تنظیم كننده فشار استفاده شود . در یك دمای معین این سرعت جریان ثابت گاز ، اجزای موجود در نمونه را در مدت معینی ( زمان بازداری ) از ستون می‌‌شوید.(11)

گازهایی كه معمولاً مورد استفاده قرار می‌ گیرند عبارتند از هیدروژن ، هلیم و نیتروژن .

گاز حامل باید دارای خصوصیات زیر باشد :

1 ـ بی اثر باشد تا از هر گونه تأثیر بر نمونه یا حلال اجتناب شود .

2 ـ قادر باشد كه نفوذ گاز را به كمترین مقدار برساند .

3 ـ به طور خالص و همی‌شه در دسترس باشد .

4 ـ ارزان باشد .

5 ـ برای آشكار ساز مورد نظر مناسب باشد . (‌11 )
2 ـ 3 ـ 2 محل تزریق نمونه

نمونه از طریق محل تزریق ( inyector ) وارد گاز كروماتوگرافی می‌ شود . این محل محفظه ای كوچك است كه یك طرف آن بوسیلة پرده ای ( Septun ) لاستیكی یا سیلیكونی پوشیده شده است . نمونه های مایع بوسیله یك ریز سرنگ مدرج كه ظرفیت آن چند میكرولیتر است از طریق پرده لاستیكی به داخل محفظه تزریق می‌ شوند . سرنگ محتوی نمونه ، پرده را سوراخ كرده وارد محفظه می‌ شود و پس از انجام تزریق و خروج سوزن ، پرده به حالت اول باز می‌ گردد و سوراخی روی آن باقی نمی‌ ماند . درمای محفظه ورودی نمونه معمولاً 50 بیشتر از نقطة جوش كم فرارترین جزء سازندة‌ نمونه است و بنابراین تبخیر آنی صورت می‌ گیرد . ( 11 و 10 )

برای جلوگیری از پهن شدن نوار ، نمونه باید كوچك باشد و به سرعت و به صورت یك « توپی » بخار وارد ستون شود . ( 11 و 10 )

برای ستونهای تجزیه ای معمولی ، اندازه نمونه از چند دهم یك میكرولیتر تا 20 تغییر می‌ كند .

در مورد ستونهای مویین چون قطر ستون بسیار كم است باید از مقادیر بسیار كم نمونه استفاده شود تاپیكهای تیز بدست آید برای این منظور یك شكافنده نمونه بكار گرفته می‌‌شود تا تنها كسر كوچكی از نمونه تزریق شده را به سر ستون حمل كند (10) این روش را Head – space آنالیز گویند.
3 ـ 3 ـ 2 ستون ها

جداسازی اجزای نمونه در داخل ستون هایی كه از فاز ساكن پر شده اند انجام می‌ شود چنانچه فاز ساكن جامد باشد آن را كروماتوگرافی گاز ـ جامد ( G S C ) می‌ نامند و اگر فاز ساكن مایع باشد آن را كروماتوگرافی گاز ـ مایع ( G L C ) می‌ نامی‌م . مایع فاز ساكن به صورت لایه نازكی بر روی جسم جامد بی اثری پخش می‌ شود . ( 11 )

برای اینكه مواد موجود در ستون ، به طور یكنواخت پر شود ستون مستقیم را ابتدا پر می‌ كنند و برای اینكه درآون قرار گیرند به صورت مارپیچ در می‌ آورند .

ستون ها به دو دسته تقسیم می‌ شوند .
الف ـ ستون های پر شده ( Packed Columu ) :

ستونهای پر شده امروزی از لوله های شیشه ای ، فلزی ( فولاد زنگ نزن ، مس، آلومینیم )‌یا تفلون ساخته می‌ شوند كه نوعاً طول 2 تا 3 متر و قطر داخلی mm 4 ـ 2 دارند ( 10 ) .

قطر خارجی ستونهای تجزیه ای استاندارد اینچ است . (‌11 )

برای پركردن ستون ، ، ابتدا باید فاز ساكن را كه یك مایع غلیظ است به صورت لایه ای روی یك جسم جامد بی اثر به نام جامد نگهدارنده كشید . برخی از خصوصیات یك جامد نگهدارنده خوب عبارتند از :

1 ـ بی اثر بودن ( جذب سطحی بر روی آن انجام نشود . )

2 ـ مقاوم در برابر خرد شدن

3 ـ مساحت سطح زیاد

4 ـ شكل منظم و اندازة یكنواخت ( 11 )

مادة ‌خام اكثر تركیباتی كه به عنوان نگهدارنده جامد در كروماتوگرافی گازی مورد استفاده قرار می‌ گیرند دیاتومه است . خاك دیاتومه سیلیكای هیدراته طبیعی است كه اسكلت دیاتومه ها را تشكیل می‌ دهد . سیلیكای طبیعی دارای تعداد زیادی گروههای OH است كه می‌ تواند باعث جذب سطحی فیزیكی گونه های آنالیت قطبش پذیر یا قطبی مانند الكل ها یا هیدوركربنهای آروماتیك روی سطوح تكیه گاه شود . این جذب سطحی منجر به پهن شدن و اغلب دنباله دارد شدن پیكها می‌ شود . برای رفع این مشكل مواد تكیه گاه می‌ توانند توسط سیلان دارد شدن با دی متیل كلرو سیلان ( DMCS ) غیر فعال شوند .

7 ـ 1 ـ 3 الكتروشیمی‌

اكسیداسیون آمانتادین در تری فلوئرواستیك اسید موجهای آندیك متعددی می‌ دهد . اطلاعات ولتامتری عبارتند از : و (13)

همچنین برای تعیین مقدار آمانتادین از روشهای كولومتری نیز استفاده شده است . ( 13)
8 ـ 1 ـ 3 فلورسانس اسپكترومتری

واكنش با Fluores camine در غلظت 1 میكرومول ، بعد از استخراج در 5 = pH با اتیل استات محصولی با ماكزیممی‌ در 475/ 395 نانومتر می‌ دهد .

حد قابل تشخیص 1 میكروگرم در میلی لیتر است . ( 13 )
2 ـ 3 بازنگری مقالات آنالیز پلاسمایی آمانتادین هیدروكلراید

1 ـ در سال 1990، Hiroyuki Fujino و Shujiro GoyaA روشی را برای اندازه گیری آمانتادین به وسیله دستگاه HPLC ارائه دادند . در این روش آمانتادین به وسیله واكنشگر3 – ( 4,6- Difluorotriazinyl ) amino-7-methoxy coumarin در بنزن در دمای 140 به مدت 5 دقیقه به مشتق فلورسانس دارد تبدیل شد . و به وسیله دتكتور فلورسانس تعیین مقدار شد . حد تشخیص در این روش fmal250 در 100 میكرولیتر ادرار بود . ( 14 )‌

2 ـ در سال 1990 DAVID C . LOCKE , JOHN , T . SCHMERMUND روشی را برای اندازه گیری آمانتادین با دتكتور فوتویونیزان ( photoionization ) دستگاه HPLC ارائه دادند . در این مطالعه از سیستم فاز معكوس و فاز متحرك آب ـ متانول ـ تری اتیل آمین ارتوفسفریك اسید استفاده شد . – حد تشخیص 25ng در هر تزریق بود.( 15 )

3 ـ در سال 1990 J.TEEUWSEN , F.A.L VAN DERHORST و همكاران روشی را برای اندازه گیری آمانتادین در ادرار با استفاده از روش HPLC ارائه كردند . در این روش میسل های كاتیونی برای مشتق سازی آمانتادین با كروموفور1-fluoro-2,4-dinitrobenzene در ادرار استفاده شد . در حضور mM90 ستیل تری متیل آمونیوم بروماید واكنش تبدیل آمانتادین به مشتق آن در مدت 4 دقیقه در دمای 60 و 1 = pH كامل شد . از سیستم فاز معكوس HPLC استفاده شد و حد تشخیص در این روش 75 بود . ( 16 )

4 ـ در سال 1993 Ira S.Krull , Feng-Xiang Zhou در آمریكا روشی را برای اندازه گیری آمانتادین در پلاسما و ادرار بوسیله automated solid phase derivatization ارائه كردند . در این روش مشتق سازی و استخراج همزمان مایعات بیولوژیك بوسیله 9-Fluoreneacetate واكنشگرمشتق ساز فاز جامد انجام شد.

مشتق آمانتادین در سیستم فاز معكوس جداسازی و بوسیله دتكتور فلورسانس اندازه گیری شد . حساسیت روش آنها برای اندازه گیری آمانتادین در ادرار و پلاسما 74/0 و 79/0 نانوگرم بود . ( حجم تزریق 50 میكرولیتر ) ( 17 )

5 ـ در سال 1980 Noall MW , Stumph mj و Knight V. روشی را برای اندازه گیری آمانتادین در ادرار به وسیله دستگاه گاز كروماتوگراف ارائه دادند . در این روش از بتا ـ فنیل اتیل آمین به عنوان استاندارد استفاده شد . نمونه های ادراری قلیایی شده و با 5/0 میلی لیتر كلروفرم استخراج شدند . فاز آلی جدا شده و مستقیماً به دستگاه گاز كروماتوگرافی تزریق شدند . پاسخ خطی در محدوده 2 تا 125 میلی گرم در میلی لیتر مشاهده شد . حد قابل تشخیص 5/0 بود . ( 18 )

در این مطالعه حساسیت روش بسیار پائین است و در واقع برای اندازه گیری آمانتادین در پلاسما حساسیت ندارد . از طرفی در این روش از 2 ـ فنیل اتیل آمین به عنوان استاندارد داخلی استفاده شده است كه یك ماده اندوژن می‌ باشد و در ادرار به مقدار قابل توجه ترشح می‌ شود .
2 ـ 3 ـ 3 ـ انتخاب استاندارد داخلی

سیكلوهگزیل آمین ، نقتیل آمین ، ایمی‌ پرامین و پسودوافدرین آزمایش شدند كه با توجه به زمان بازداری و عدم تداخل با مواد آندوژن پسودوافدرین به عنوان مناسب ترین استاندارد داخلی انتخاب گشت.
3 – 3 ـ 3 ـ حلال استخراجی

حلالهای كلروفرم ، هگزان و دی اتیل اتر مورد بررسی قرار گرفتند . كه با توجه به میزان بازیافت و نیز انتخاب پذیری بهترین نتایج با دی اتیل اتر بدست آمد .
4 ـ 3 ـ 3 ـ آماده سازی نمونه های سرمی‌

1-4-3-3- خصوصیات خون و انواع روشهای استخراج

با توجه به اهمیت بسیار بالای استخراج دارو از مایعات زیستی (خون، پلاسما یا سرم و ادرار) ، لذا ابتدا مختصری راجع به این مایع زیستی (خون) و انواع روشهای استخراج توضیح داده می شود و یك مقایسه نسبی نیز بین این روشها و مزایا و معایب آنها نسبت به هم ارائه می گردد.

خون پیچیده ترین مایع زیستی است كه پس از دریافت از انسان و یا حیوان به صورت مایعی شفاف و بافر شده محتوی پروتئین های محلول، چربیها و نمك های محلول در آب و سلول های معلق می باشد. خوشبختانه جزء اصلی خون یعنی گلبولهای قرمز یا ارپترویست ها به سادگی از محلول شفاف یا پلاسما توسط سانتریفوژ كردن قابل جداسازی است، معهذا در صورت عدم دقت در عملكرد با خون سلولها می توانند شكسته شده و روش عملی جداسازی بسیار پیچیده گردد.

به طور كلی هیچگاه خون به طور مستقیم استخراج نشده، بلكه ابتدا همیشه سرم یا پلاسما تهیه و سپس بقیه عملیات بر روی آنها صورت می پذیرد، در صورتیكه مستقیم از خون صورت پذیرد باید تدابیر لازم جهت اجتناب از پارگی سلولهای قرمز اتخاذ گردد.

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *